1.5　纤维素酶的糖化

1.5.1　纤维素酶的吸附

木质纤维生物质的酶糖化过程是由纤维素酶来完成的，首先是酶吸附到木质纤维底物上，故底物对纤维素酶的吸附量直接影响到水解效率。底物对纤维素酶分子的吸附分为纤维素对纤维素酶的特异吸附和木质素对纤维素酶的非特异吸附两类。纤维素是不可溶性底物，酶若要与之发生反应首先要与之接触，即吸附到纤维素分子上；反应结束后，酶又要从纤维素分子上及时解吸下来，以便吸附到纤维素分子上的另一个部位，继续催化下一个反应。外切葡聚糖酶（CBH）能被吸附在纤维素大分子的结晶区，内切葡聚糖酶能被吸附在纤维素大分子的非结晶区和一些结晶区，它们在水解过程中都经历着“吸附－催化－解吸－再吸附”这一重复过程。纤维素结合域（CBD）是纤维素酶和纤维素之间的桥梁，CBD连接酶分子的催化域和结晶纤维素，研究表明CBD能够增加纤维素酶在底物上的浓度，在高底物浓度下能够增加底物对纤维素酶的非特异性吸附[87]。用木瓜蛋白酶代替CBHⅠ的CBD后，微晶纤维素对CBHⅠ的吸附从0.293nmol/mg减少到0.103nmol/mg；而无定形区纤维素对CBDⅠ的吸附量没有影响[88]。纤维素酶去除CBD后对可溶性底物活力影响较小，而对结晶纤维素的吸附和水解活力则有明显降低。反应体系中加入里氏木霉纤维素酶的CBD，内切葡聚糖酶和CBHⅠ水解性能得到了提高。β-葡萄糖苷酶不会与纤维素发生吸附，王丹[89]在4℃高速搅拌及在50℃中速振荡两种条件下研究β-葡萄糖苷酶对纯纤维素的吸附情况，结果表明，两种条件下β-葡萄糖苷酶都不被吸附。但是，在水解木质纤维过程中β-葡萄糖苷酶会发生非特异吸附的现象，其原因可能是大分子的β-葡萄糖苷酶陷于木质素与纤维素的孔隙中，或不可逆吸附于木质素本身。如果催化可溶性底物反应的酶被固形物吸附的话，那么酶就类似于被固定化，从而存在较大传质阻力，酶的表观活力会大大下降[90]。

纤维素酶和木质素之间的吸附属于不可逆吸附，可能会受到水合作用的改变（疏水/亲水相互作用），静电作用、范德华力和氢键的影响。纤维素酶是一种蛋白质，表面含有正负电荷的多聚两性电解质。蛋白质的疏水残基含有大量的如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等疏水性氨基酸，当蛋白质在水相中折叠时，大部分非极性氨基酸藏在分子内部，还有少部分的非极性氨基酸暴露在蛋白质外部，可通过水合作用或氢键作用与疏水性物质相结合。纤维素和木质素表面都具有高的疏水性。在水解过程中，CBH酶或EG酶的疏水性氨基酸会和纤维素或木质素的疏水性基团发生竞争性的特异性或非特异性吸附。蛋白质的结构重排也会影响到纤维素的分子内氢键，导致纤维素酶吸附量的变化。Palonen[91]用Langmuir等温吸附方程研究了木质素对纤维素酶的吸附现象，结果表明CBH和EG都可能吸附到碱木质素和酶解木质素上。

1.5.2　纤维素酶的作用方式

1950年，Reese[92]提出了纤维素酶降解纤维素的C1-Cx假说，如图1.2所示。他们认为C1酶首先作用于结晶纤维素使其变成无定形纤维素，再被Cx酶进一步水解成可溶性纤维素和葡萄糖的β-1，4-聚合物，即C1酶的作用是Cx酶水解的先决条件；接着β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和三糖水解成葡萄糖。20世纪60年代以来，由于分离技术的发展，纤维素酶的各组分被分离提纯，但C1-Cx假说并未在实验中得到证实，即如用C1酶作用于底物（结晶纤维素），然后将C1酶与底物分离，再加入Cx酶和β-葡萄糖苷酶，如此顺序并不能将结晶纤维素水解。

纤维素酶使纤维素转化成葡萄糖的过程中，协同降解方式主要有两种观点。一种观点[92]认为，在协同降解过程中，首先由外切葡聚糖酶水解不溶性纤维素，生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖；然后由内切葡聚糖酶作用于纤维糊精，生成纤维二糖，最后由β-葡萄糖苷酶将一分子的纤维二糖水解为两分子的葡萄糖。另一种观点[93]认为，在协同降解过程中，首先由EG酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶区进行切割，产生新的末端；然后由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位由末端进行切割，最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。原子力显微镜观察结果显示，外切酶的作用使结晶纤维素的表面结构发生了变化，这种变化使得内切酶的作用变得容易，由此表现出两种酶的协同作用。这三种组分虽各有专一性，但相互之间又具有协同作用，如图1.3所示。该解释较C1-Cx假说更合理。

1.5.3　酶糖化过程的影响因素

由于木质纤维生物质复杂的“钢筋混凝土结构”，酶很难像水解淀粉一样将纤维素完全水解成葡萄糖。因此，木质纤维原料的酶糖化效率不仅与酶的活性有关，也与纤维原料的物理、化学和形态特征有关。影响酶糖化的因素主要分为两大类：纤维素酶和底物[94]，其中，与纤维素酶相关的因素主要集中在改善酶的活性，包括酶的产物抑制效应、热稳定性及吸附性能。与底物相关的因素则主要集中在提高纤维素的可及度，如纤维素结晶度、半纤维素和木质素的含量与分布情况、比表面积及预处理过程产生的抑制物等。

1.5.3.1　纤维素的聚合度和结晶度

纤维素的聚合度（DP）是表征纤维素链中葡萄糖单元通过β-苷键连接的程度。在木质纤维生物质水解过程中，纤维素聚合度的变化既受到纤维素酶中各种组分比例的影响，也与纤维基质的物理特性有关[95]。然而，尽管水解过程中部分纤维素被溶解，DP降低，但是随着水解的进行，结晶度提高以及其他物理化学性质的变化而使得纤维素的“顽抗性”不断增强，最终纤维素的DP随着水解时间的延长而不发生改变，达到一种稳定状态[96]。因此，聚合度（DP）是否为限制纤维素酶水解的决定性因素，或者其与其他影响因素，如结晶度、可及性和表面积等相互关联，最终限制纤维素酶水解的问题仍然没有研究清楚。

天然或人工的纤维素由无定形区和结晶区组成，结晶区和非结晶区之间没有严格的界限，一个纤维素分子链可以连续穿过若干个结晶区和非结晶区。纤维素的结晶度是指纤维素中结晶区占据纤维整体的百分率。在纤维素水解过程中，只有将单根糖链分离出来，糖链才能有机会接触到酶的催化位点，从而提高水解效率，但是结晶区内纤维素链以极其稳定的晶体排列，严重限制了酶分子和底物的接触，因而纤维素的结晶度被认为是限制纤维素酶水解的重要因素之一[97，98]。在酶糖化反应的初期，纤维素的结晶度显著影响纤维素的降解速率，纤维素的结晶度和水解效率呈现正相关的关系。在纤维素的酶水解过程中，纤维素酶首先移除无定形区，随着水解的进行，较难水解的结晶纤维素作为残留物，导致了结晶纤维素的累积，从而增加了底物与酶的不可及性。研究表明，使用球磨等方法处理纤维素后，纤维素的结晶度显著降低的同时，纤维素的表面积、可及性以及半纤维素和木质素分布也发生了变化，这些也是影响酶水解的重要因素。对于天然的木质生物质而言，结晶度并非是影响纤维素水解的唯一因素。

1.5.3.2　比表面积和孔径

木质纤维原料的比表面积是影响纤维素酶糖化率的一个重要因素[99]，而比表面积很大程度上又受木质纤维原料孔径的影响。一般来说，减小纤维原料的孔径可以增大比表面积，从而增加纤维素的酶解效率及葡萄糖得率。当样品被分散成纳米级别时，纤维素比表面积显著增加，大多数纤维素暴露于纤维素酶的环境下，使得短时间内纤维素几乎完全水解。此外，孔隙体积也是影响纤维素酶解率的一个重要因素。孔隙体积与初始酶解速率呈线性关系，当底物的孔隙多，大小不一的纤维素酶进入空隙，纤维素的酶解效率显著提高。据Rollin等[100]报道，使用有机溶剂处理柳枝稷后，原料中纤维素的可接触面积提高了16倍，使用氨水预处理移除木质素后，纤维素的可接触面积只提高了1.4倍，并且有机溶剂预处理后的柳枝稷的水解效率显著高于氨水预处理后的水解效率，说明在某些情况下，增加纤维素的可接触面积比移除木质素更能提高木质纤维原料中纤维素的酶水解效率。

1.5.3.3　木质纤维素中半纤维素和木质素含量及分布

由于纤维素嵌入在木质纤维原料的网状结构中，并且与木质素和半纤维素相互作用，因此木质素和半纤维素的存在阻碍了纤维素与酶的接触，使得纤维素的酶解效率降低。纤维素和半纤维素之间并没有共价键作用，而是通过氢键和微纤丝紧密连接，采用水热预处理能够将植物纤维原料中的半纤维素组分有效去除，这有利于随后的纤维素酶解。除此之外，木聚糖酶也能够显著水解半纤维素，游离态的木聚糖会聚集吸附到纤维素的表面，阻碍纤维素酶和纤维素的接触[101，102]。为了减少木聚糖对木质纤维原料降解的抑制作用，木质纤维原料中的木聚糖需要被转化为游离态或者降解为可溶性的糖；可通过在酶水解过程中添加木聚糖酶，将低聚木糖转化为木糖，从而缓解低聚木糖对纤维素酶水解的抑制作用。另外，半纤维素的乙酰基也会阻碍木质纤维原料酶水解。

在木质纤维原料中，木质素填充在细胞壁的微纤丝、基质多糖及蛋白质的外层，与纤维丝、基质多糖等共价交联，使得纤维素和非纤维素物质间的氢键增强。此外木质素和细胞壁中的非纤维物质形成化学键，使得纤维素部分和非纤维素部分进一步黏合，起到加固木质化植物组织的作用。细胞壁的木质化使得纤维素酶对底物的可及性降低，阻止了降解酶和底物的接触，因而木质素的存在对木质纤维原料的降解有非常不利的影响。木质纤维原料经过预处理之后，仍然有大量的木质素残留在水解底物上，研究表明天然木质纤维原料约含15%～30%木质素，经预处理后，木质素相对含量最大可达到40%左右。因此，木质素除了通过物理阻碍作用限制纤维素酶在纤维素上的可及性之外，还会由于纤维素酶在木质素上的无效吸附而减小木质纤维生物质的酶解效率。纤维素酶在木质素上发生无效吸附的作用主要有疏水作用、静电作用和氢键作用[103～105]。疏水作用被认为是纤维素酶和木质素之间发生吸附的主要驱动力。当纤维素酶在水中溶解之后，纤维素酶的疏水基团在水溶液中伸展，使得具有疏水性的纤维素酶与固体表面（木质纤维生物质）因为疏水作用而吸附在一起。并且有研究显示木质素的接触角比纤维素的接触角要小，说明木质素的疏水性比纤维素要强[103]。其次，木质纤维生物质的酶解是在酸性条件下进行的，而纤维素酶的等电点（pI值）介于3.5～9.5，故酶解液中会有部分纤维素酶带正电荷[104]；而木质素上的酸性基团（如羧基和酚羟基）的离子化会使木质素带负电，使得纤维素酶和木质素之间存在静电吸引力，发生无效吸附。此外，纤维素酶和木质素之间的氢键作用也被报道，木质素上的羧基和酚羟基与纤维素酶和木质素之间的氢键有关[105]。但是，纤维素酶和木质素之间的疏水、静电吸附和氢键作用机制以及其对木质纤维生物质酶解的抑制作用的机理还没有得到确切的验证。因此，有效去除木质素既可以减少木质素的无效吸附，也增加了木质纤维原料的孔径和比表面积。

尽管脱木质素对木质纤维原料的降解有非常大的益处，但是根据目前的预处理水平，完全脱除木质纤维原料中的木质素需要非常高的成本。并且在高温预处理过程中部分木质素首先会从固有的状态分离降解，但不会从木质纤维原料中脱除，而是会重新聚合到底物表面，继续影响纤维素酶的水解效率。

1.5.3.4　底物浓度

底物浓度是影响纤维素酶催化效率的主要因素之一，研究发现酶解的初速度和得率受底物浓度影响。在一定范围内，底物浓度越高，酶与底物接触的机会越多，所以有利于酶水解反应。在较低的底物水平，底物浓度增加通常引起水解产率和反应速率增加，但设备的利用效率低，并造成后续发酵的乙醇分离生产成本过高。增加酶水解底物浓度不仅可提高最终葡萄糖的得率，也可降低用于加热和冷却流体的能耗以及减少最终排放的废水量。但不是底物浓度越高越好，底物浓度越高，意味着酶溶液体积相对变小，造成反应产物不易扩散，会抑制酶的水解，严重降低水解速率。因而如何平衡两者的矛盾，有效提高酶水解的效率是当前研究的重点。

1.5.3.5　纤维素酶用量及纤维素酶抑制物

增加纤维素酶用量可以提高酶水解速率，更主要的是能够减少完全水解所需要的时间。在一定酶浓度范围内，随着酶用量的增加，纤维素酶解得率增大；但当酶用量增加到一定程度后，水解速度增加缓慢。主要是由于纤维表面最初吸附的酶为单分子层，吸收过量的酶形成多分子层后，只有纤维第一层吸附的酶对水解反应有重要影响，当这些结合点全部被纤维素酶分子饱和后，再增加纤维素酶用量也起不到提高得率的作用。用纤维素酶对麦草进行酶解，在5g底物中，酶用量100mg之前，酶解速率增加较快，100mg之后，增加缓慢，说明一定量的纤维素在一定条件下，纤维素分子和酶分子的结合点数有限，当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶用量，起不到酶解作用。并且在目前纤维素酶的成本降低的情况下，也不可能无限制地增加酶用量[106]。

纤维素酶的活性受纤维二糖、低聚木糖、葡萄糖以及预处理过程中产生的一些降解产物如弱酸、糠酸、5-羟甲基糠醛和一些可溶性酚类物质的影响。在纤维素糖化过程中，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶受不断增加的纤维二糖抑制，而β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的累积更敏感，但对于整个纤维素酶系纤维二糖的抑制作用强于葡萄糖。主要是因为纤维二糖能与纤维素酶蛋白中的色氨酸作用形成空间位阻，限制了纤维素酶活性位点与纤维素分子链的接触，从而抑制了纤维素的水解。纤维二糖的抑制作用可通过加入外源β-葡萄糖苷酶解除；葡萄糖的抑制作用可通过真空抽滤和超滤及时除去生成的单糖，或通过同步糖化发酵（SSF）技术解除终产物抑制，但SSF法由于酶解与发酵温度的差异，限制了它的工业应用[107，108]。

与纤维二糖和葡萄糖相比，低聚木糖对纤维素的酶解抑制作用更大。在较低的浓度下，低聚木糖可降低纤维素的初始酶解速率，导致最终葡萄糖得率降低。此外，当水热或蒸汽爆破处理木质纤维原料时，产生的弱酸、糠醛、5-羟甲基糠醛和一些可溶性酚类物质也会抑制纤维素的酶水解过程。弱酸和低分子酚酸对纤维素水解的抑制作用主要是通过破坏细胞内pH环境和阻碍生物生长需要的三磷酸腺苷的生成而实现的。因此，通过优化木质纤维生物质的预处理条件，降低甚至完全去除抑制物，可以最大限度地提高纤维素酶的活性以提高纤维素酶糖化的效率。