第一章 诊断病理学的任务和准则
一、什么是诊断病理学
病理学是研究疾病病因、发病机制、形态结构改变以及由此而引起的功能变化的一门基础医学与临床医学之间的桥梁学科。病理学作为一门科学是在18世纪中期开始的。Morgagni（1682—1771）将他一生中所经历的约700例精心解剖的尸检各器官所见与临床表现相联系，于1761年著成了《疾病的位置与原因》一书，此书为病理学的发展奠定了基础。以后许多学者将尸检所见与临床表现相联系，相继发现了许多疾病的临床和形态特点，大大丰富了病理学的内容。尸检成为检验临床诊断正确性必不可少的程序。这样的器官病理学到19世纪Rokitansky（1800—1878）时代达到了顶峰。Rokitansky亲自解剖了约3万例尸体，并掌握了约6万例尸检的材料，详细描述了全身各器官的各种病变，从而极大地丰富了病理学宝库。1843年Virchow开始用显微镜观察病变部位的细胞和组织的结构，1858年Virchow发表了他著名的“细胞病理学”，从而开创了细胞病理学时代。临床各科的发展推动了病理学向专科病理分支如妇产科病理、神经病理、肿瘤病理、皮肤病理及儿科病理等的发展。1932年Knall和Rusha发展了透射电镜，1938年Ardenne首创了扫描电镜。电子显微镜的问世使病理学从细胞水平向亚细胞结构深入，由此产生了超微结构病理学。免疫学的进展促进了免疫病理学和免疫组织化学的发展。细胞遗传学的研究进展进一步充实了有关疾病的遗传病理学。20世纪50年代是生物化学突飞猛进的时期。1953年Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构及DNA-RNA-蛋白质（包括各种酶）的化学顺序。分子生物学技术目前在病理学中的广泛应用促使病理学进一步深入到分子水平，为分子病理学的建立奠定了基础。随着新一代测序（next-generation sequencing，NGS）、液体活检等技术的飞速发展，基于大数据的精准医学时代已经到来，为分子病理学带来了前所未有的机遇与挑战。近年来，信息化、数字化技术的发展也大力推动了数字病理的进步，为远程会诊、计算机辅助诊断的实现提供了可能。
综上所述，近百余年来由于医学生物学各分支如生物学、微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、生物信息学等的迅猛发展以及许多新仪器如透射电镜、扫描电镜、荧光显微镜、图像分析仪、流式细胞仪、组织芯片仪、显微切割仪、NGS仪等的成功研制，使病理学能发展到目前这样具有许多分支的重要学科，当然病理学的发展也必然会促进临床医学的发展。
应该强调的是病理学从建立之时起就负有一个重要使命即协助临床医生对疾病作出诊断。古代学者通过肉眼观察器官改变与临床症候相联系。细胞病理学问世后，病理医生能从细胞和组织结构的改变为临床提供病理诊断。1870年柏林大学的Carl Ruge及其同事Johann Veit最先将外科活检作为重要的诊断工具。从此以后病理医生可根据手术标本、各种活检、穿刺及脱落细胞学为临床不同疾病提供诊断。尸检更可核实或纠正临床诊断，或发现新的疾病和病变。病理学中这一方面的实践和研究以往称为外科病理学，通俗称为临床病理诊断，这些名称并不全面，因为送病理科作病理诊断的标本不都是来自外科，几乎所有的临床科室都可能送病理标本，所以应称之为诊断病理学（diagnostic pathology）。诊断病理学不仅包括对各种活体标本（包括细胞学）的诊断，也包括对尸检的诊断。诊断病理学是病理学的一个大分支，是为患者的医疗服务中不可缺少的重要组成部分。
二、诊断病理学的任务
诊断病理学的任务是对有关疾病：①提出明确的病理诊断；②提供可能的病因学证据或线索；③提供有关的预后因素。当病理学还处在细胞病理学时代时，病理医生能根据病理标本的形态改变（大体和显微镜下）提出病理诊断已经是完成了任务。目前随着医学生物学各分支的迅速发展，病理医生已能将病理形态结合其他种种辅助手段如电镜、组织化学、免疫组织化学、流式细胞术、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、PCR、NGS、数字PCR及其他分子生物学技术为临床提供更精确的病理诊断。例如过去单凭形态不能区分的小细胞恶性肿瘤，现已能依靠免疫组织化学和电镜区分出淋巴瘤、小细胞未分化癌、胚胎性横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤或Ewing瘤。分子生物学技术特别是PCR的应用使病理医生能从患者的组织（新鲜或石蜡包埋组织）中提取DNA，通过PCR得到大量扩增的特异性DNA片段用于检测T、B淋巴细胞增生中Ig或TCR基因重排、癌基因和抑癌基因的点突变，检测杂合子丢失（lose of heterozygote，LOH）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），检测循环血中的肿瘤细胞等。PCR也可用于检测微生物包括细菌和病毒。对检测病毒来说，PCR技术是最敏感和最快的方法。流式细胞术的一个重要功能是DNA分析，决定瘤细胞的倍体（ploidy），计算出不同细胞周期中细胞的百分率，如肿瘤中异倍体和S期细胞百分率增加表明恶性，对某些肿瘤如膀胱癌来说，这些指标说明预后差，对一些癌前病变来说，DNA分析可预测该病变的生物学行为。对于一些组织学难以分类的淋巴造血系统肿瘤以及软组织肿瘤，现在通过FISH等技术检测染色体异位与重排情况，可以明确诊断。病理诊断医生虽不直接接触患者，但面对临床医生，在临床医生诊断治疗患者的过程中，病理诊断医生应是临床医生最好的咨询者和合作者。
三、进行诊断病理学实践和研究所需的设备
无论是大的医学院校附属医院的病理科，还是小的县区级医院病理科，他们的主要任务是进行病理诊断，其设备应包括有设备较齐全的尸检室、手术和活检病理标本检查取材室、常规切片制片室（可包括特殊染色及冷冻切片设备）、细胞室（包括制作各种细胞学和细针穿刺细胞学的涂片和切片等）、医生读片室（或称诊断室）、免疫组织化学室、大体标本制作室、大体标本陈列室以及各种材料的存档处（包括文字档案、标本、玻片及蜡块存档处）等。随着计算机与网络技术的普及，各级医院的病理科还应配有性能良好的计算机与图像采集设备（摄制各种大体标本和显微镜下照片）及安全可靠的病理图文信息系统（laboratory information systems，LIS），以方便病理报告的查询、打印、存档，实现图像及文字资料的信息化管理与质量控制。另外，病理科日常工作中会接触大量的有毒有害物，并产生大量废水、废物，应配备通风设备、废液回收及处理设备，以保护环境及保障人员健康。
一个现代化大医院病理科还应有分子病理学实验室、细胞培养室、组织库（配备超低温冰箱、液氮罐等）、电镜室（扫描及透射电镜）、塑料包埋切片制作室，备有细胞遗传学工作站（FISH分析系统）、real-time PCR仪、NGS平台、一代测序仪、显微切割仪、组织芯片仪、荧光显微镜、偏光显微镜、双头及多头显微镜（教学用）、流式细胞仪、图像分析仪等设备。有条件的单位可安置虚拟切片（virtual slide）的仪器及远程病理会诊的仪器，这样同一城市不同医院及不同城市医院之间甚至不同国家的医院之间可进行切片会诊交流。
四、病理标本的检查、取材和诊断中的一些要点
（一）大体观察和取材
病理标本的检查，常规应包括大体检查和显微镜下观察。一些诊断病理医生重视显微镜下改变，忽视大体形态，认为镜下形态是诊断的主要依据。殊不知，对于许多标本，特别是手术切除标本的大体形态和取材部位可直接影响诊断正确性，如对于手术切除的甲状腺，只重视大结节，忽视了小的白色硬结，可导致微小乳头状癌的漏诊；对于大的卵巢肿瘤，应作多个大切面观察，应在不同色泽和质地的部位取材检查，因卵巢肿瘤经常有混合型，只取少数瘤组织块，不能代表肿瘤的全部成分。总之标本的大体观察非常重要，要全面仔细观察和描述病变。临床送检的标本不管大小均应详细检查，如果一例标本有多件，则每一件均要取材作切片观察。根治术标本在未固定前应仔细寻找淋巴结，因为淋巴结中癌的转移率直接影响患者的治疗和预后。对于肿瘤标本，除取不同部位的肿瘤外，还应取肿瘤浸润最深处、肿瘤与正常组织交界处、切断端及淋巴结。
（二）大体标本的照相
一般医院的病理科都没有很富裕的空间来存放大体标本，因此在对大体标本检查之后，对一些病变典型、特殊或罕见的标本最好尽量照相留档，这样除少数可制成陈列标本外，日常大量已检查并取材的大小标本，在病理报告发出后一段时间（一般为1～2个月）就可弃除。如果检查当时没有详细记录，可对照照片进行补充描述。照相前应将病变充分暴露，剔除多余的脂肪和结缔组织。标本的切面一般来说均较表面有特征性，照相的清晰度和反差等取决于设备及摄影者的技术。目前一些大医院用的连接电脑的数码相机照相设备不仅效果好，亦容易掌握。一张好的彩色图像不仅是存档的重要资料，也是总结和书写论文必不可少的材料。储存在电脑中的大体彩色图像还可制成光盘作为教学和会议交流等用。
国外许多医院病理科还备有照大标本的X线设备，对检查有钙化的病灶以及骨组织很有用。
（三）固定
常用的固定液有10%中性甲醛溶液，其他有Zenker、Bouin和Carnoy等固定液。固定液的体积应10倍于标本的体积。10%甲醛溶液的渗透组织能力为1mm/h，所以一般标本均需固定数小时，大标本切开后应固定过夜。用作取组织块的大标本，应在新鲜时就切成0.5～1cm厚的大片块，待固定后再修整，组织块厚度不能超过3mm。腔状器官如胃肠道，应将标本剪开后用大头针固定在薄的木板上（黏膜面向上），在大的容器内固定，表面覆以浸有固定液的湿纱布或棉花。需要立埋的标本应用大头针或染料标明需要包埋的面。标本不能冻存，特别是已含固定液的标本，因冷冻后水分在组织内形成针状结晶，破坏组织和细胞的结构，从而影响诊断。
（四）一张好的HE切片是保证正确病理诊断的关键
病理切片质量的好坏除取决于病理制片室的设备以及病理技术人员的技术和经验外，部分还取决于病理医生取材是否合乎要求，如大标本未经适当固定就取材，这样的组织块在固定、脱水和浸蜡过程中会扭曲变形，影响包埋和制片；另外，组织块太厚、中心脱水透明及浸蜡不好亦影响切片质量。一张质量上乘的HE切片（除疑难病变外），对病理医生来说，一般不会发生诊断困难，但质量很差的HE切片（切片厚、刀痕多、组织细胞挤压、组织裂开及染色透明差等）总会造成诊断上的困难，特别是淋巴结。大多数淋巴结的疑难病例是由于制片造成的。
目前虽然已有许多辅助手段和工具，如电镜及免疫组织化学等，但要做这些辅助检查之前，首先要对该病例有一个初步的病理诊断意见，才能考虑用什么手段或什么工具来进一步证实或否定该诊断，所以对于一天要处理大量病理标本和诊断的病理医生来说，质量好的HE切片是完成工作的保证。
（五）免疫组织化学
除了HE染色外，以往常用的辅助诊断方法有特殊染色、酶组织化学、图像分析和电镜等，20世纪70年代末和80年代初免疫组织化学已开始在国内少数大医院病理科应用于日常外检，到90年代后期免疫组织化学已在全国普遍开展，由于免疫组织化学较高的敏感性和特异性，所以迄今免疫组织化学已是医院病理科不可缺少的技术，协助疾病的病理诊断、鉴别诊断以及分子分型。免疫组化技术在指导肿瘤靶向治疗上也扮演着重要的角色，如乳腺癌及胃癌中的Her-2免疫组化检测。罗氏公司近年开发的ALK Ventana免疫组化检测方法在不影响检测特异性的情况下，大大提高了ALK融合蛋白免疫组化检测的敏感性，且由于其在全自动免疫组化仪器上操作、检测流程得以标准化、结果判读可重复性高、与FISH结果吻合度高，在国内已被广泛应用于非小细胞肺癌的临床检测，指导针对ALK的靶向治疗。此外，针对PD-1/PD-L1信号通路的肿瘤免疫治疗是近年肿瘤研究领域最重要的进展之一，免疫组化检测肿瘤细胞PD-L1的表达水平可能有助于筛选适合接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的患者。
（六）小活检和细胞学
随着医学的发展，病理医生所收到的标本越来越小，现在医院病理科除手术切除的标本和手术切除活检外，大量的是各种内镜活检、粗针穿刺活检和细针吸取细胞学检查（fine needle aspiration cytology，FNAC）的标本。越来越小的标本就要求病理医生仔细检查和病理技术人员高水平的制片技术。遇到有些小的内镜活检首先要核对“块数”，如内镜医生注明“8块”，则送检瓶内应核实是否有“8块”。除检查瓶内标本外，还应检查瓶盖内是否还有标本，有时这一块行将“漏网”的活检可能恰恰是病变的关键。小的标本如内镜活检应用纱布或滤纸等裹起来固定、脱水和浸蜡。特别小的标本应用伊红染色后再包裹固定、脱水、浸蜡，否则浸蜡后小标本与蜡混在一起不易辨认。这种小活检的切片要求技术人员用快刀切，并在载玻片上捞数个至十数个蜡片。病理医生看片时每一切片上的组织片均应仔细观察，有时常常在某几个组织片中有具诊断意义的病变。
细胞学（亦称诊断细胞学）现在越来越广泛用于诊断。近年来开发的液基薄层涂片技术、电脑辅助细胞扫描分析系统（thin layer liquid based with computer-assisted cytology test，TCCT），以及用液基薄层涂片技术加上DNA自动扫描仪，均可明显提高宫颈癌的检出率，以上技术和仪器亦可用于胸腹腔积液、尿、脑脊液和痰的细胞学检查。除各种脱落细胞学外，细针穿刺吸取细胞学检查（FNAC）已在全世界广泛开展。细针是指针的外径为0.6～0.9mm，由于针细损伤小，吸出的细胞是存活的，所以制成涂片后较脱落细胞学（细胞常退化）更易诊断。目前FNAC几乎已能用于穿刺全身所有部位的肿瘤，它的阳性率高，假阳性极少，所以很受临床和病理医生欢迎。FNAC的成败取决于：①穿刺医生能击中目标；②制成一张薄而均匀的涂片；③病理医生对诊断细胞学的经验。三者中缺一就可影响诊断。
细胞印片，特别是怀疑有肿瘤的淋巴结切面的印片对诊断很有参考价值，因一张好的印片比起冷冻切片和石蜡切片来说可真实反映细胞的形态和结构，并可用于免疫组织化学，因此除了纤维组织较多的组织和肿瘤外，一般细胞丰富的组织和肿瘤，在新鲜标本切开后最好都做印片观察。
五、冷冻切片
手术台上做冷冻切片的唯一理由是决定下一步治疗的方案，如乳腺肿块的良恶性决定是否需作根治术，又如肢体肿瘤的性质决定是否要截肢等。除了这一原因外，其他均无申请作冷冻切片的理由。对病理医生来说，冷冻切片要求快、准确、可靠。但是冷冻切片的质量一般不如石蜡切片，另外取材有限，因此并不是所有的冷冻切片都能做到快、准确和可靠。所以不能作出明确诊断时，应请临床医生再取代表性的组织或请临床医生等石蜡切片的结果，切勿勉强诊断，以造成误诊或事故。
六、病理材料的存档及信息化
如前所述，大体标本应尽量照相存档，或储存在电脑数据库内。这样经过一段时间后，大体标本就可处理掉。除已制成示教或陈列的标本外，大体标本不宜长久保留（包括尸检标本），一方面这些标本占据很大的空间；另一方面长期保存的大体标本不仅色泽、外形均会改变，而且这种标本已不适合取材作一般HE切片，更不适合用于其他辅助诊断技术。
文字资料（包括各种报告的存档部分）、病理切片及蜡块均应永远保存。这些材料犹如患者的病例一样，随时可用于复查，特别是一些疑难病例，多次的手术标本或活检集中起来复查时可能会得出更明确的诊断。此外，这些材料也是病理医生教学和科研用的第一手资料。有些医院病理科把病理切片和蜡块如同大体标本一样“定期处理”，这是不可取的。有时常常因为患者的病理资料不全而影响诊断，甚至可造成医疗纠纷或失去解决医疗纠纷的依据。
目前最好的储存办法是将文字资料输入实验室信息系统。国外以及国内一些大的医院病理科在做尸检和外检的同时以及发出正式报告后，随即将病理诊断和患者的有关资料编码输入实验室信息系统。这样不仅起到了存档作用，更方便的是随时能从电脑中提出有关病例的病理资料，以资复习和研究。目前，国际上通用的编码参考SNOMED（The Systematized Nomenclature of Medicine）。
21世纪以来，病理日常报告及材料的存档已全部信息化（通过电脑传送及储存），有些单位甚至已废除文字档案材料、实现无纸化，这样的做法似乎有些极端，笔者认为每一病例的最后病理报告包括临床病史、标本的大体形态（包括照相）、显微镜下形态特点、病理诊断及分子病理诊断均应有一份纸质的文字资料存档，在信息系统出现问题时提供补救的机会。
七、病理诊断医生与临床医生密切联系
病理诊断是医院对许多患者的医疗服务中的一个重要环节。病理诊断医生虽然不直接面对患者，但他作出的正确病理诊断可使患者获得正确的治疗。相反，错误的病理诊断可延误患者的治疗，甚至导致重大的医疗差错或事故。
临床医生应像请其他科医生会诊那样，向病理医生提供必要的病史、手术所见及实验室检查结果。当然有些典型的病变，不需要临床病史就能作出诊断，但多数情况下病理医生在作出诊断前需要参考病史，因为形态相似的肿瘤发生在不同部位，可能作出不同的诊断，如儿童头面部的小细胞恶性肿瘤，很可能是胚胎性横纹肌肉瘤，而发生在儿童肾上腺的小细胞恶性肿瘤则神经母细胞瘤的可能性大；又如发生在子宫的平滑肌肿瘤，核分裂5/10HPF仍诊断为平滑肌瘤（细胞性平滑肌瘤cellular leiomyoma），但同样的平滑肌瘤发生在消化道则已能诊断为平滑肌肉瘤。类似的例子很多。总之，适当的临床病史是病理医生作出正确诊断必不可少的。国外许多诊断病理专家对没有病史的病理标本一概不予以诊断。
对于要求手术中做冷冻切片的病例，临床医生更有责任事先向病理医生介绍病情，甚至请病理医生到手术室去观察病变性质、部位及切除作冷冻切片组织的部位，这样使病理科的医生和技术人员能做好物质上和思想上的准备，从而有利于病理医生做出快、准确和可靠的冷冻切片诊断。
临床与病理医生应经常组织临床病理讨论，保持密切沟通和合作，及时了解彼此的需求以及学科的最新进展，以更好地为患者服务。有条件的单位可推动在欧美国家已得到普及的多学科综合治疗（multi-disciplinary team，MDT）模式，组织临床、病理、影像、超声、放疗、麻醉等相关科室专家围绕某一病例进行讨论，综合各学科意见，为患者制订出最佳的治疗方案，以患者为中心，实现个体化治疗。近年来，临床医生对病理报告内容的要求越来越细致、深入，病理科可根据临床医生需求，制订针对各个系统不同类型标本（如活检标本、根治标本、新辅助治疗后标本）的规范化诊断模板，防止内容遗漏。
临床医生与病理医生要相互理解、相互支持。有些临床医生把病理医生看作技术人员或化验员，这种不平等的对待造成一些医院病理医生与临床医生之间的隔阂和关系紧张。另外，一些病理医生只管看片子，毫不关心患者的情况，也不满足临床医生提出的合理要求。临床和病理医生不能密切合作，只能是对患者不利。我们提倡病理医生和临床医生加强合作，相互理解、相互信任，为了患者的利益，共同努力。
八、质量控制和质量保证
质量控制和质量保证的最终目的是保证病理报告的正确性、完整性和及时性，原则上每家医院病理科都应有质量控制和质量保证（QC/QA）计划，并有一个小组或委员会来执行和检查此QC/QA计划。目前国内许多医院还没有做到，不过有些城市已由卫生厅、卫生局指定某一或几个医院执行全市各医院QC/QA的检查。
最简单的QC/QA措施：①检查每天组织切片和（或）细胞涂片的质量；②每天病理报告应由高年资医师复查后发出；③定期比较冷冻切片和石蜡切片诊断的符合率和正确率；④定期抽样检查病理报告有无诊断差错和文字书写（包括诊断、患者的姓名、年龄和性别等）差错；⑤定期召开科内和科间对疑难和特殊病例的会诊。
现代化的病理科需要制定严格的室内质量控制措施、完善的管理制度以及相关技术规范；还需要按要求定期参加室间质量评价或进行有效的实验室室间比对，如国家卫生健康委员会（原卫计委）病理质控评价中心（Pathology Quality Control Center，PQCC）及各省市病理质控中心组织的室间质评活动。有条件的病理科可争取通过ISO15189认可及CAP认证。
九、医院病理科的医疗法律纠纷问题
病理科医疗法律纠纷的主要原因是病理诊断错误即误诊和漏诊。另一种原因是标本或切片编号错误“张冠李戴”和标本丢失，特别是在未做大体检查前丢失标本，这是绝对不可原谅的错误，因为发生这种情况在法庭上是绝对败诉的。
造成病理诊断错误的原因与病理诊断医师的专业水平和素质、切片质量、病理科的设备以及医院的大环境等都有关。病理诊断医师的专业水平低，对有些病变不认识或工作不够敬业（粗枝大叶，看切片不仔细，漏了重要的病变）；病理科设备差（如没有合格的显微镜），则专业水平很高的病理医生也看不出病变；技术人员水平低或没有合格的制片设备，做不出合格的HE切片。国内许多到处会诊的“疑难外检”中有很大一部分是“制片疑难外检”，即因病理切片质量不好，会诊医生不能根据切片所提供的真实信息作出正确的诊断。
一旦发生医疗法律纠纷，应把有关病例的文字档案、切片、蜡块和剩余固定的组织标本等妥善封存，或交上级有关部门保管，切勿将这些资料交给无关的第三者特别是原告及其律师，一旦立案，最重要的是绝对不要更改报告或记录，这样可使案件变得不可辩护。国外的法院可将私自修改报告判成有罪。
在法庭上要保持冷静，衣着整洁，要说真话，实事求是，前后一致，回答问题简单明确，尽量少加修饰词。
病理诊断医生不可能不犯错误，也不可能保证一生不被起诉，所以病理诊断医生亦应认真地学习有关法律知识。
十、分子病理学
分子病理学（molecular pathology）亦称分子遗传病理学（molecular genetic pathology）。早在20世纪90年代，国外一些大的医学中心已建立了分子遗传病理学学科，如果说20世纪后期免疫组织化学成为推动病理学发展的巨大动力，21世纪广泛开展的分子遗传学及其技术将成为第2个推动病理学发展的巨大动力。21世纪医学已进入了“个性化医学”与“精准医学”时代。“个性化医学”特别是“个性化癌的医学”核心是靶向治疗，靶向治疗已在某些癌患者的治疗中广泛开展。而精准分子病理诊断是靶向治疗的基础，不同的分子改变对应着不同的靶向治疗手段。分子病理学的研究表明许多疾病特别是一些癌的分子水平异质性很强，即同样形态的癌，它的基因水平可完全不同。例如，两个同样形态的乳腺浸润性导管癌，一个伴有HER2/neu基因扩增，另一个则没有HER2/neu扩增。这两个患者治疗就不能用“一种尺寸适用于所有人”的办法，而要用“量体裁衣”的方法，即要根据肿瘤分子水平的异常进行针对性治疗，以获得最大的疗效及最低的药物毒性。又如，组织形态同样为肺腺癌，分子水平伴或不伴EGFR突变或EML4-ALK融合等，会有截然不同的靶向治疗策略。除靶向治疗外，分子病理诊断还在肿瘤早期诊断、分子分型、预后判断、化疗耐药性的判断、耐药与复发监测等过程中扮演着越来越重要的角色。鉴于肿瘤分子病理学领域近年来突飞猛进的发展，近期出版的几种WHO肿瘤分类（中枢神经系统、泌尿系统及男性生殖、淋巴造血系统）均将分子病理检测置于前所未有的重要位置上，越来越多的肿瘤类型需要借助于分子病理手段来明确诊断。在新的形势下，诊断病理学工作者，除作出病理形态诊断外，迫切需要掌握各种分子遗传及分子病理学知识与进展。
随着肿瘤等疾病分子遗传学与分子病理学的快速进展与精准医学时代的到来，需要开展的分子病理学检测项目越来越多，传统分子检测技术在检测敏感性、通量、成本、时效性、样本量等方面均面临着巨大的挑战。近年来，NGS技术的飞速进展已将其应用由研究领域拓展至临床检测，如遗传性疾病、实体肿瘤、血液系统肿瘤、感染性疾病、HLA分析及非侵袭性产前筛查。基于DNA的NGS检测根据检测的范围与复杂程度可以分为以下三个层次：①疾病目标基因集（targeted gene panels）测序；②外显子组测序；③全基因组测序。NGS平台还可以进行全转录组测序、全基因组DNA甲基化测序、单细胞测序等。NGS技术提供了一个高敏感性、高通量、高性价比的遗传学异常临床检测平台，给分子病理学带来前所未有的机遇，预示着分子病理学新时代的到来。与传统分子检测技术比较，NGS技术的巨大优势在于其能够在较短的时间内利用相对较低的成本完成多种突变类型、多个位点、多个目标基因、全外显子组甚至全基因组的同时检测，可以节省样本，且时效性好、性价比高。例如，美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）结肠癌指南自2015年第2版开始强烈推荐对所有转移性结肠癌患者的肿瘤组织（原发肿瘤或转移灶）进行扩展的RAS基因突变检测（包含KRAS 2号外显子、KRAS2号外显子以外区域以及NRAS），具有KRAS或NRAS已知突变的患者均不应接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。目标区域的NGS检测（包含多个基因外显子区域）能够很轻松地完成上述检测任务，节省样本、时间及成本，结果判读简单，还可以同时进行BRAF等其他结直肠癌相关基因突变、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）甚至肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）的检测，协助预后分层，指导免疫治疗。目前，NGS检测平台及试剂盒已可利用低至10ng的样本DNA量实现目标区域上百个基因的同时检测，因而也非常适合用于小活检标本以及细胞学标本的检测。例如，利用定制或购买的商品化肺癌NGS panel，可以在肺癌的穿刺标本甚至胸水标本中同时检测EGFR、BRAF、KRAS等基因的点突变与小片段插入缺失（indels）、c-MET扩增及14号外显子的跳跃突变，以及ALK、ROS-1、NTRK1、RET重排等。
过去几年里，国内外能够开展NGS检测的实验室出现了井喷式的增长。然而，NGS在国内的临床应用仍存在着比较多的问题，如：①在实验室操作与生物信息学分析等方面仍缺乏规范化；②由于使用的测序平台、试剂盒、生物信息学分析软件、样本类型、样本DNA质量等方面的差别，难以制定统一的结果判读标准；③目前仅有少数NGS平台及试剂盒通过CFDA认证；④NGS技术仍处于不断地改进与完善之中；⑤缺乏既有医学及遗传学背景又兼具生物信息学知识的交叉学科人才，结果的临床意义解读存在一定困难；⑥检测到的低丰度突变难以用传统技术验证，且其临床价值尚存在争议；⑦临床全外显子组与全基因组测序中偶然发现（incidental findings）的解读与报告。国内外已开始制定相关的共识、指南与规范。美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）于2013年制定了“ACMG NGS临床实验室标准”；美国病理学家协会（College of American Pathologists，CAP）也成立了NGS工作小组，于2014年制定了“CAP NGS临床检测实验室标准”；欧洲临床分子诊断标准化工作组Eurogentest与欧洲人类遗传学会（European Society of Human Genetics，ESHG）于近期也制定了“诊断用NGS指南”，指导遗传性疾病诊断时的NGS检测评估与验证。国内的中国肿瘤驱动基因分析联盟（China Actionable Genome Consortium，CAGC）也于近期公布了“NGS应用于肿瘤精准诊治的共识”；国内病理学界也组织相关专家制定了《临床分子病理实验室NGS检测专家共识》《BRCA数据解读中国专家共识》《基于NGS技术的BRCA基因检测流程中国专家共识》等一系列共识，期望推动并规范行业的发展。就现阶段而言，最适合应用于肿瘤临床检测的是包含数个至数百个肿瘤热点基因的NGS panel检测。检测样本可以是肿瘤组织样本（包括FFPE样本），用于指导治疗（靶向治疗、免疫治疗等）、辅助诊断、判断预后；也可以是外周血、唾液等，用于肿瘤遗传易感性检测（检测前后需进行遗传咨询）。
液体活检是近年兴起的一项临床应用前景广阔但又富有挑战性的分子检测新技术。目前，液体活检的检测对象主要包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）和外泌体。血液cfDNA或血液循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是目前最常用的液体活检，其检测方法主要有super ARMS、NGS、数字PCR等。液体活检在肿瘤早期诊断、预后评估、治疗疗效及耐药监测中均具有重要的潜在应用价值，但是目前仍主要处于临床前探索阶段。
近年来新出现的分子检测新技术还有数字PCR（digital PCR）、RNAscope、三代测序技术等。数字PCR技术是一种全新的核酸分子绝对定量技术。与传统的定量PCR方法相比较，数字PCR技术采用绝对定量方式，灵敏度高，结果具有高度重复性，适用于肿瘤液体活检、NGS结果验证、病原微生物检测等。RNAscope是一种新的RNA原位检测新技术，能够在组织细胞原位水平对单分子RNA生物标志物进行定性及定量分析，具有高灵敏度与特异性，且能够进行多重荧光和显色标记，为伴随诊断生物标志物的识别和验证提供了有力的工具。
虽然这些新的分子检测技术目前主要还停留在科研探索阶段，在检测成本、规范化、质量控制等方面尚存在诸多问题，但是病理学界应该重视这些新技术的出现与进展，把握发展趋势，在条件允许的情况下积极展开新技术的探索与实践以及相关人才的贮备与培养。需要强调的是，传统的组织病理学仍然是分子病理学检测的根基，例如，基于肿瘤组织的分子病理检测必须要先明确肿瘤的病理诊断、组织学分型以及肿瘤含量等信息。
十一、数字病理与人工智能
数字化病理系统的应用最早开始于1985年（20世纪80年代中期），20世纪90年代在美国开始被应用于商业领域。从2000年开始在医学院校逐步取代传统显微镜。近年，随着计算机信息化技术的发展、互联网的普及以及大数据时代的到来，数字病理的临床应用在国内外得到了愈来愈多的重视，并且取得了长足的发展。
数字病理系统主要由数字切片扫描装置和数据处理软件构成。将传统玻璃切片通过扫描装置扫描采集成高分辨率的数字化图像，制作生成整张全视野的数字化切片（whole slide image，WSI）。再将这些数据存储在一定介质中建立起数字病理切片库。随后就可以利用相应的数字病理切片浏览软件，对其进行任意比例放大或缩小以及任意方向移动的可视化浏览和分析处理，如同操作一台真实的光学显微镜。除常规切片外，近年来还通过外加相应的荧光光源和更换滤光镜扫描等手段实现了荧光切片的数字化，克服了荧光切片容易褪色、不宜长久保存的缺点。
与传统病理材料的存贮与浏览方式相比，数字病理具备诸多优势。数字病理切片与图像易于保存，通过数字化存贮来保存珍贵的病理切片资料，解决了传统玻璃切片易损坏、易褪色、存储空间大、存贮环境要求高等问题。使用者可以在本地或通过网络很方便地对数字切片进行信息检索、浏览、传输以及管理，并且多个使用者可以在不同地点同时对同一张切片进行浏览，为远程病理会诊、国内外学术交流讨论、教学等提供了极大的便利，对基层及偏远地区医院病理诊断水平的提高及病理人才的培养有重要的帮助。国内外还有人提出全数字病理科的概念，期望实现数字切片首诊的目标，推动病理诊断专科化、提高病理诊断效率与准确性。
更为重要的是，近年来，越来越多的国内外研究者开始尝试通过信息技术（特别是人工智能技术）对数字切片与病理图像进行精确识别与分析（定性、定量），实现计算机辅助病理诊断，并推动组织病理学信息与临床资料、实验室检查结果、影像学结果、分子病理数据等的高效整合，实现对患者的精准医疗。虽然目前数字病理在设备费用、数字化切片标准、数据存贮与传输能力、图像识别与分析技术等方面仍有很大的完善与改进空间，但是，数字化、信息化、智能化是诊断病理学未来发展的趋势，有条件的单位应该去积极探索与实践。
在现今的大数据与精准医疗时代，组织病理学、免疫组织化学、分子病理学、数字病理及人工智能等领域的发展日新月异，病理诊断工作越来越精细与繁杂，需要我们医院病理工作者不断学习与提高，抓住机遇，迎接挑战。诊断病理学的发展更需要医院领导及有关临床医生的支持与理解，医院领导应支持病理科建立分子病理学实验室及数字病理系统（包括各种必需的新的仪器、设备），增加有关实验室人员，积极开展各种新技术。医院领导、临床医生以及病理科工作人员的目的是一致的：使患者得到最合适的诊疗。
（刘彤华 吴焕文）