任务2.4　苷类的结构研究

苷类多为固体化合物，其结构研究一般按照下面步骤进行。

第一步：物理常数的测定，如测定熔点、比旋度等。

第二步：分子式的测定。

经典的方法是进行元素的定性和定量分析，并测定分子量，确定分子的组成和分子式。近年来广泛应用质谱分析的方法测定分子量和分子式。苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热汽化时易于分解，采用电子轰击质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）等方法来获得分子离子峰，尤其是FD-MS及FAB-MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量的常用方法，其中高分辨快原子轰击质谱法（HR-FAB-MS）还能够直接测定苷类化合物的分子量。

2.4.1　组成苷的苷元和糖的鉴定

将苷用稀酸或酶进行水解，使之生成苷元和各种单糖，然后再对这些水解产物进行鉴定。

将苷用稀酸进行水解，使生成苷元和各种单糖，分得苷元，测定质量，计算苷元在苷中所占的百分数，或进行糖的定量分析，计算糖在苷中所占的百分数。利用PC或TLC鉴定水解液中单糖的种类，并可进一步采用光密度扫描计测定各单糖斑点的含量，算出各单糖的分子比，以推测苷元与哪些单糖相连以及单糖的个数。

糖的极性强，因此在硅胶薄层上进行色谱分离时，一般点样量不能大于5μg，而用硼酸溶液或一些无机盐的水溶液代替水调制吸附剂进行铺板，就能显著提高点样量，并改善分离效果。用这种盐的水溶液制备硅胶薄层时，所用的盐一般是强碱弱酸（或中强酸）盐，如0.3mol/L的磷酸氢二钠水溶液。用这种盐溶液制备的硅胶板分离糖时，其上样量可达400～500μg。

糖的PC或TLC所用的显色剂有些是相同的，其显色原理主要是利用其还原性或形成糖醛后引起的呈色反应。有些显色剂不仅可以决定糖的斑点的位置，尚可区分其类型。常用的显色剂有苯胺邻苯二甲酸试剂、三苯四氮盐试剂（TTC试剂）、间萘二酚-盐酸试剂、双甲酮-磷酸试剂等。这些显色剂对不同的糖往往显示不同颜色（见表2.1）。

有些显色剂中含有硫酸，因此只能用于TLC，例如茴香醛-硫酸试剂、间萘二酚-硫酸试剂、α-萘酚-硫酸试剂、百里酚-硫酸试剂、酚-硫酸试剂等。喷后一般要在100℃左右加热数分钟至斑点显出。

纤维素薄层色谱与纸色谱相似，也属分配色谱，可用于糖的分离和鉴定。纸色谱所用的展开剂和显色剂均能用于纤维素薄层色谱，但后者展开所需时间比前者显著缩短。

2.4.2　确定苷键的构型

2.4.2.1　利用酶水解进行测定

如麦芽糖酶只能水解α-苷键，而苦杏仁酶能水解β-苷键。但应注意并非所有的β-苷键都能被杏仁苷酶所水解。

2.4.2.2　利用Klyne经验公式进行计算

Klyne根据前人的经验，得出一个经验公式，可用以计算。即将未知苷键构型的苷及其水解所得的苷元，先测定其旋光度，再通过计算得到其分子比旋[M]D，然后再用苷的分子比旋减去苷元的分子比旋，求得其差值为Δ[M]D。公式如下：

将此差值与形成该苷的单糖的一对甲苷分子比旋相比较，如果α-甲苷的数值相近，可认为其苷键为α-苷键，反之则可认为其苷键为β-苷键。常见甲苷的分子比旋数值见表2.2。

【例】　黄甘草皂苷[glyeurysaponin]的苷键构型的计算。

黄甘草皂苷是存在于黄甘草（Glycyrrhiza eurycarpa P.C.Li）中的一种三萜酸葡萄糖醛酸苷。其苷键构型利用Klyne经验公式，就可确定。

计算方法如下：

黄甘草皂苷

查表2.2，可知：

β-D-葡萄糖醛酸甲苷+β-D-葡萄糖醛酸甲苷[M]D=-411.8°

β-D-葡萄糖醛酸甲苷+α-D-葡萄糖醛酸甲苷[M]D=-110.2°

α-D-葡萄糖醛酸甲苷+α-D-葡萄糖醛酸甲苷[M]D=+191.4°

由于计算值-477.7°与-411.8°较接近，因此可确定其苷键为β型。

2.4.2.3　根据核磁共振谱中糖的端基质子的耦合常数或端基碳原子的化学

位移（或其耦合常数）进行判断

（1）1H-NMR

利用1H-NMR谱中糖的端基质子的耦合常数判断苷键的构型是目前最常用的方法。一般是采用全甲基化物进行测定。当糖与苷元相连接时，糖上端基质子与其他质子相比较，常位于较低磁场。

凡是H—2'为a键的糖，如木糖、葡萄糖、半乳糖等，当与苷元形成β-苷键时，其H—1'为a键，故H—1'与H—2'为aa键耦合系统，Jaa=6～9Hz并呈现为1个二重峰。当形成α-苷键时，其H—1'为e键，故H—1'与H—2'为ae键耦合系统，Jae=2～3.5Hz，故从J值可以确定苷键的构型。现以葡萄糖苷为例，从其透视式及部分纽曼投影式可以更清楚地看出以上的现象。

从纽曼投影式可以看出，在α-D-葡萄糖苷中，其C1上的e键氢（He）与C2上的a键氢（Ha）之间的夹角Φ为60°，J值为2～3Hz，而在β-D-葡萄糖苷中，其C1上的a键氢（Ha）与C2上的a键氢（Ha）之间的夹角Φ为180°，J值为6～9Hz。

C2上H为e键的某些糖，如鼠李糖等，由于它所形成的苷键的α构型与β构型的J值相近，因此也就无法利用其J值来确定其构型。例如鼠李糖苷。

从鼠李糖苷的部分纽曼投影式可以看出：在α-L-鼠李糖苷中，其C1'上的e键氢（He）与C2'上的e键氢（He）之间的夹角为60°，而在β-L-鼠李糖苷中，其C1'上的a键氢（Ha）与C2'上的e键氢（He）之间的夹角亦为60°，它们的J值都为2Hz左右，因此不能利用其J值确定其构型。

（2）13C-NMR

碳谱的化学位移值范围较大，因此一种苷的α构型和β构型中端基碳原子的化学位移常用以判断苷键的构型。糖和苷元连接后，糖中端基碳原子的化学位移明显增加，而其他碳原子的化学位移则变动不大（见表2.3）。

在某些α和β构型的甲苷中，其端基碳原子的化学位移相差较大，常用以判断苷键的构型。表2.4是一些常见的α-和β-甲基吡喃糖苷端基碳原子的化学位移。

从表2.4可以看出，除D-甘露糖甲苷和L-鼠李糖甲苷外，绝大多数单糖的甲苷，其α和β构型的端基碳原子的δ值都相差约4，因此可以用其δ值来确定其构型。在实际应用中，因溶剂及苷元结构的不同，δ值可有差别。

①呋喃糖甲苷。

②溶剂为吡啶-d。

此外，也可利用耦合常数来确定苷键的构型，表2.5是几种甲苷的值。

从表2.5可以看出：α-甲苷端基碳原子的值约为170Hz，而β-甲苷端基碳原子的值约为160Hz，两者相差较大，约10Hz，故可利用值确定苷键的构型。

2.4.3　确定糖和糖之间、糖与苷元之间的连接位置

糖与糖之间连接位置的确定已在前节多聚糖内容中介绍过。对于糖和苷元键合位置的测定，苷元分子中如果有两个以上羟基，只通过水解反应就不能确定糖和苷元的结合位置，还必须结合其他方法。最常用的方法是先将苷进行全甲基化，然后用含6%～9%HCl的甲醇进行甲醇解，分解出甲基化的苷元，证明其结构式后，在其分子中唯一的羟基，就是和糖结合的位置。苷的甲基化反应常用的方法主要有以下四种，前两种为经典的方法，后两种是半微量的现代方法。

（1）Haworth法

用硫酸二甲酯和氢氧化钠（或碳酸钠、碳酸钾）可使醇羟基甲基化，其缺点是如果欲进行全甲基化反应，必须进行多次反应才能达到目的。

（2）Purdie法

用碘甲烷和氧化银为试剂（一般可在丙酮或四氢呋喃中进行），可使醇羟基甲基化，但因氧化银具有氧化作用，故只能用于苷的甲基化，而不能用于还原糖的甲基化。

（3）Kuhn改良法

在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，加入碘甲烷和氧化银或硫酸二甲酯及氢氧化钡（或氧化钡），在搅拌下进行甲基化，缺点是反应较为缓慢。

（4）箱守法（Hakomori）

在二甲基亚砜（DMSO）溶液中，加入氢化钠，以碘甲烷进行甲基化反应。其反应机理是二甲基亚砜与氢化钠先生成甲基亚磺酰碳负离子，然后在甲基亚磺酰碳负离子的存在下进行甲基化反应，因此氢化钠的二甲基亚砜溶液又称为甲基亚磺酰碳负离子溶液。

但因二甲基亚砜和NaH的碱性较强，有酯键的苷类易被破坏，不宜使用该法，而应采用Kuhn改良法。

2.4.4　苷中糖与糖之间连接顺序的确定

决定苷中糖与糖之间连接顺序的方法同前面所述及的多聚糖中糖与糖之间连接顺序的确定一样。